SEMEN BEKU

LEARNING OBJECTIVE

1. PROSES PEMBUATAN SEMEN BEKU
2. KANDUNGAN KOMPOSISI SEMEN

Proses Pembuatan Semen Beku
Preservasi Semen pada Domba
Penampungan Semen

Penampungan semen dilakukan dengan vagina buatan yang terdiri atas tabung karet yang berlubang pentil, karet inner liner, karet pengikat, corong karet, dan tabung penampung berskala. Air panas (40-52oC) dimasukkan ke dalam vagina buatan melalui lubang pentil hingga mencapai setengah bagian, kemudian lubang pentil ditutup dan dipompa. Kekenyalan vagina buatan diukur dengan jari jika dirasakan cukup, karet bagian luar vagina buatan diberi vaselin hingga 1/3 bagian panjangnya. Domba betina pemancing (teaser) dimasukkan ke dalam service create, selanjutnya domba pejantan dibiarkan mendekati domba betina pemancing beberapa kali untuk meningkatkan libido dan setelah domba pejantan menaiki pemancing, bagian preputium dipegang, ujung penis diarahkan ke lubang vagina buatan dengan posisi miring. Semen yang tertampung segera dievaluasi secara makroskopis dan mikroskopis.

Pengenceran Semen

Setelah diketahui jumlah volume pengencer sampelsemen dibagi dua bagian, satu bagian diencerkan dengan Sitrat-kuning telur dan satu bagian lagi diencerkan Tris-kuning telur melalui metode pengenceran satu tahap (one step method). Pengenceran dengan metode satu tahap, dilakukan dengan cara memasukkan pengencer melalui dinding gelas erlenmeyer yang berisi semen secara perlahan hingga seluruh pengencer tercampur homogen. Pencampuran antara semen segar dan pengencer dilakukan pada suhu kamar atau menggunakan water bath bersuhu 30oC.

Ekuilibrasi

Proses ekuilibrasi dilakukan setelah sampel semen dicampur dengan masing-masing bahan pengencer pada gelas erlenmeyer yang telah diberi label SKT (sitratkuning telur) dan TKT (tris-kuning telur), berlangsung selama 2 jam di dalam lemari pendingin (refrigerator) bersuhu 5oC. Selama proses ekuilibrasi berlangsung, sampel semen pada setiap perlakuan pengencer sitrat dan tris-kuning telur dilakukan penambahan gliserol sebanyak 7% dari total volume pengencer secara perlahan-lahan melalui dinding gelas Erlenmeyer (proses gliserolisasi) sampai seluruhnya tercampur merata.

Pengisian straw (packing)

Pengisian straw dilakukan dengan menggunakan filler (mikropipet) yang dihubungkan dengan slang plastik pada alat penghisap. Bagian ujung ministraw yang terbuka ditutup dengan cryoseal atau alat sealer. Ministraw dibedakan dalam tiga warna yaitu biru untuk tingkat perlakuan laju penurunan suhu 7oC/menit; kuning untuk tingkat perlakuan laju penurunan suhu 13oC/menit, dan merah untuk tingkat perlakuan laju penurunan suhu 20oC/menit. Sedangkan untuk membedakan jenis pengencer straw ditandai kertas label SKT dan TKT, setiap perlakuan diulang 4 kali.

Pembekuan Semen

Pembekuan semen dilakukan secara manual menggunakan kotak styrofoam, yang dibagi menjadi tiga ruang pembekuan yang sama. Di dalam setiap ruang pembekuan terdapat wadah aluminium penampung N2 cair, dan rak tempat straw dengan ketinggian berbeda, berturut-turut 10, 11 dan 12 cm dari permukaan N2 cair. Bagian atas kotak Styrofoam diisolasi dengan kaca setebal 5 mm, dan pada setiap ruangan diberi lubang untuk memasukkan sensor thermometer digital saat mengamati suhu pembekuan. Proses pembekuan pada setiap ruangan, diawali dengan menuangkan N2 cair ke dalam wadah aluminium pada setiap ruang pembekuan setinggi 5 cm. Selanjutnya straw diletakkan pada rak-rak yang ada, dengan bagian atas ditutup kaca sebagai isolator. Untuk memperoleh suhu pembekuan yang berbeda, straw dibekukan hingga –80oC pada tiga tingkat suhu uap N2 yaitu -95, -105, dan -135oC, yaitu dengan cara mengatur ketinggian rak tempat straw dari permukaan N2 cair, setinggi 12, 11, dan 10 cm. Straw warna biru dibekukan pada ketinggian rak 12 cm di atas permukaan N2 cair, selama 2 menit 50 detik, straw kuning pada ketinggian rak 11 cm selama 1 menit 55 detik, dan straw merah pada ketinggian 10 cm selama 1 menit 45 detik, hingga mencapai suhu pembekuan –80oC.

Evaluasi Semen Beku

Evaluasi semen beku dilakukan setelah straw di thawing di dalam minitub bersuhu 39oC selama 2 menit, sampai semen dalam straw benar-benar mencair, kemudian sampel semen dikeluarkan untuk dievaluasi secara mikroskopis sesuai dengan peubah yang diamati (Herdiawan., 2004).

Preservasi Semen pada Anjing

Spermatozoa dapat bertahan hidup pada ejakulat tanpa pengencer dalam waktu yang singkat sampai maksimal 21 jam. Apabila semen akan digunakan dalam waktu yang agak lama misalnya dikirim ke luar kota maka semen perlu diencerkan dan didinginkan.

Pengencer ditambahkan ke semen untuk mengubah buffer PH; untuk memberikan sumber energi bagi spermatozoa; untuk mencegah pertumbuhan bakteri; dan untuk mencegah kerusakan spermaozoa selama pendinginan, pembekuan, thawing. Beberapa pengencer dapat digunakan untuk pendinginan semen maupun untuk pembekuan semen; dan krioproektan seperti gliserol diperlukan hanya pada pengencer yang digunakan untuk semen beku. Penegencer semen anjing secara komersial telah tersedia, tetapi komposisinya tidak tertulis atau dirahasiakan oleh perusahaan tersebut.

Buffer digunakan untuk menjaga keseimbangan ion dan PH di dalam larutan pengencer. pH optimal dari pengencer semen adalah 6,75 sampai 7,5; osmolalitas optimum adalah 300 sampai 325 mOsm. Penggunaan zwitterionik buffer seperti tris (hydroxymethil) aminomethane (TRIS), dan potassium buffer, seerti potasium hydroxide, telah dilaporkan pada pengencer semen anjing. Sodium sitrat mengikat logam berat pada plasma seminal.

Glukosa, dekstrosa, dan laktosa telah telah dijelaskan sebagai sumber energi pada penegncer semen anjing. Cairan seminal anjing mempunyai konsentrasi fruktosa yang sangat rendah dibandingkan cairan seminal pada spesies lain, kemungkinan disebabkan karena anjing jantan tidak mempunyai vesikula seminalis. Fruktosa dapat digunakan sebagai sumber energi pada spermatozoa anjing.

Kuning telur dan gliserol adalah komponen yang paling sering digunakan dalam pengencer semen anjing untuk melindungi spermatozoa dari cold shock dan kerusakan selama pembekuan dan thawing. Persentase spermatozoa motil ynag progresif sesudah pembekuan adalah tertinggi dengan menggunakan pengencer yang mengandung kuning telur 20 % dari volume, dibandingkan dengan 5 atau 10 %. Gliserol mempunyai berat molekul rendah sehingga dapat memasuki sel spermatozoa dan mengikat air intraseluler, menurunkan pemebentukan es intraselluler dan membantu menghilangkan air dari sel secara perlahan.

Pengawetan semen dengan pendinginan

Persentase sperma motil yang progresif pada sampel yang diawetkan dengan pendinginan pada 4° sampai 5°C menurun secara gradual dengan waktu. Penurunan motilitas yang nyata terjadi lebih cepat pada pengencer yang mengandung 20% kuning telur dari pada pengencer susu skim. Jika susu skim digunakan harus dipanaskan 92°-95° C selama 10 menit untuk denaturasi enzim dalam susu. Untuk mengoptimalkan angka kebuntingan, pengawetan semen anjing dengan pendinginan terbaik digunakan dalam 48 jam setelah koleksi. Semen anjing biasanya diawetkan pada rata-rata 1 bagian semen ke 2-3 bagian pengencer.

Tahapan untuk mendinginkan semen :

Pertama kali dilakukan evaluasi dari kesehatan reproduksi pejantan dengan pemeriksaan fisik lengkap dan evaluasi semen, termasuk kultur semen dan serologi Brucella canis, dan uji untuk gangguan genetik yang khusus untuk ras tersebut. Koleksi semen dapat dilakukan dengan masturbasi pada anjing.

Kemudian pisahkan fraksi kedua (yang kaya spermatozoa) dengan mengganti tabung selama koleksi. Encerkan fraksi yang kaya sperma dengan pengencer I (lihat tabel) pada temperaur kamar, pada rasio 1 bagian semen dengan 2 bagian pengencer. Simpan semen yang telah di encerkan di dalam tabung sentrifus dan utup yang rapat. Masukkan pada kotak styrofoam yang lebih besar dengan 2 ice pack beku, bungkus dengan koran. Kirin ke tempat betina yang membutuhkan sesegera mungkin, idealnya dalam waktu 24 jam.

Pengiriman dapat dilakukan dengan thermos es yang diisi dengan pecahan es. Tabung sentrifus plastik yang telah diisi semen tersebut ditutup rapat kemudian dilindungi dengan menempatkanya didalam kantung yang tertutup, seperti kantung plastik dengan tabung yang berisi semen kemudian ditempatkan dalam thermos diatas pecahan es dan kemudian ditutup yang rapat. Semen harus dengan hati-hati dihangatkan lagi ke suhu 30-35 ° C sebelum digunakan untuk inseminasi.

Pengawetan semen dengan pembekuan

Penggunaan semen beku untuk IB pada anjing tidak seluas seperti pada sapi atau kuda. Anjing jantan harus mempunyai kualias semen ynag sangat bagus dan betina yang akan diinseminasi dengan semen tersebut harus sudah dewasa dan tidak ada gangguan infertilitas atau penyakit pada saluran reproduksinya.

Semen dapat dibekukan di dalam ampul, dalam straw atau dalam pelet. Pelet dibuat dengan mendinginkan semen yang diencerkan dimasukkan kebagian 50-100µl ke dalam solid dry ice, da kemudian disimpan dalam vial nylon yang berlubang pada nitrogen cair. Straw polyvinylchloride (PVC) bervolume 0,25 atau 0, 50 ml dapat diisi dengan semen yang telah diencerkan dan didinginkan, tutup pada ujung akhir dan tutup pada bagian lain, diuapkan diatas uap nitrogen cair dan kemudian straw dimasukkan ke dalam nitrogen cair.

Rata-rata pemebekuan semen anjing yang optimal tergantung pada pengencer dan krioprotektan yang digunakan dan volume dari sampel. Nilai rata-rata pemebkuan dilaporkan bervariasi dari 1, 89 ˚C ke 5 ˚C permenit sampai sampel mencapai - 5˚C, kemudian 10˚C ke 20 ˚C per menit sampai sampel mencapai - 100˚C, sesudahnya sampel dimasukkan ke dalam nirogen cair.

Menjelang penyimpanan jangka panjang semen beku, sempel dari pelet aau straw yang mengandung semen beku yang telah di masukkan ke nitrogen cair paling tidak 5 menit kemudian harus di thawing dan dievaluasi untuk mendapatkan kualitas semen posthawing. Motilitas progresif adalah parameter yang paling sering dinilai untuk evaluasi kualitas spermatozoa anjing yang dithawing setelah pembekuan. Persentase spermatozoa motil yang progresif menurun setelah thawing, dengan nilai yang dilaporkan adalah kurang lebih 50-60%.

Total konsentrasi 100x 106 spermatozoa/ ml digunakan secra rutin untuk pembekuan. Tetapi sewaktu semen dengan kuaitas yang tinggi separuh dari konnsentrasi tersebut, misalnya 50x106spermatozoa dapat digunakan. Dosis IB dari 100-150 juta spermatozoa hidup telah dihubungkan dengan angka konsepsi 75% atau lebih tinggi, tergantung pada kesehatan reproduksi anjing betina waktu inseminasi , dan penempatan semen dalam saluran reproduksi betina.

Metode pembekuan semen anjing telah banyak dilaporkan termasuk teknik menggunakan pengencer dan material. Salah satunya adalah semen yang sudah diencerkan dimasukkan langsung kedalam nirogen cair dan teknik menggunakan methanol sebagai media pembekuan.

Tahapan untuk memproduksi semen beku :

Setelah anjing jantan dievaluasi kesehatan reproduksinya lengkap seperti pada proses untuk pendinginan semen. Pisahkan fraksi yang kaya spermatozoa dengan mengganti tabung selama koleksi. Tambahkan pengencer I, pada suhu kamar, pada perbandingan 1:1. Tempatkan pada suhu refrigerator selama 1 jam. Label 0, 5 ml straw dengan memberikan nomor identitas, nomor hewan, ras, dan tanggal. Tambahkan 2 bagian pengencer II, pada suhu refrigerator , pada empet bagian 0,5 ml selama periode 45 menit untuk konsentrasi final gliserol 4%. Isi straw 0,5 ml, masukkan gelembung udara untuk mencegah ledakan sumbat selama pembekuan, tutup straw , dan tempatkan di suhu refrigerator selama paling tidak 1, 5 jam. Isi dasar dari kotak styrofoam dengan nitrogen cair. Tempatkan straw pada rak 5 cm di atas permukaan nitrogen cair selama 6 menit, kemudian jatuhkan straw ke dalam nitrogen cair. Sesudah paling tidak 5 menit, pindahkan ke kontainer dan thawing satu straw (60 detik pada waterbath 37 oC) untuk menilai kualitas semen post-thawing. Pengiriman sampel semen dalam kanister yang mengandung nitogen cair atau uap nitrogen cair dalam dry shipper. Yang terakhir akan bertahan selama 1-3 minggu ; recharge kanister pada saat kedatangan ditempat tujuan atau timbang setiap hari untuk mengetahui berkurangnya nitrogen cair dan mungkin hawing satu straw. Informasi yang harus dikirim dengan semen termasuk petunjuk thawing, jumlah spermatozoa dalam setiap straw, dan persentase progresif motilitas setelah thawing.

Pengencer untuk pendinginan semen : komponen diencerkan dalam 1000 ml air
Pengencer 1:14, 5 gr Na sitrate ; 12,5 g dekstrose; 250 ml kuning telur; 1000 U/ml K penicillin; 1000µg/ ml streptomisin.800 gr cream (12 % lemak); 200 gr kuning telur ; 1000 U ml benzyl penicillin, 1 mg/ml dihydrostreptomycin.Pengencer untuk semen beku : komponen diencerkan dalam 1000 ml air

Pengencer II:14, 5 gr Na sitrate ; 12,5 gr dekstrose; 250 ml kuning telur; 1000 U/ml K penicillin; 1000µg/ ml streptomisin; 80 ml gliserol 29 gr TRIS; 13,2 gr sodium sitrate; 12,5 gr fruktosa; 200 ml kuning telur; 80 ml gliserol

Thawing

Straw di thawing dalam water bath (thermos) pada 70˚C selama 8 detik. Sesudah thawing, straw harus dipegang secara vertikal, ujung filter dibawah dan penutup (segel ) di atas, kemudian diketok dengan jari agar gelembung udara ditengah straw berpindah keatas. Straw dipotong pada segelnya dan satu tetes semen ditempatkan pada mikroskop slide pada temperatur 37 ˚C dan periksa dengan mikroskop untuk mengetahui kualitas sesudah thawing. Sering spermatozoa perlu beberapa waktu untuk mulai bergerak sesudah thawing, tetapi 2 menit pada plat penghangat sudah cukup untuk mengembalikan motilitasnya.

Pengenceran semen terdiri dari buffer, lemak, nutrisi, antibiotic dan gliserol:

• Buffer berguna mengontrol pH (yang berupa buffer ialah sodium sitrat, kuning telur, dll)
• Lemak : melindungi membran sitoplasma dari suhu (susu skim dan kuning telur)
• Nutrisi : mempertahankan metabolisme sel spermatozoa (glukosa dan fruktosa)
• Antibiotic : menekan pertumbuhan bakteri (penisilin dan gentamisin sulfat)
• Gliserol : melindungi spermatozoa ari efek merusak dari proses pendinginan
• Sitrat : memperbaiki daya hidup spermatozoa, sebagai pengganti penyanggah fosfat dalam pengenceran kuning telur yang berguna untk preservasi daya hidup dan fertilitas spermatozoa (Anonim., 2008).

Kandungan Komposisi Semen
Komposisi semen murni :

• Fructosa : berguna bagi spermatozoa sebagai sumber energi dalam bergerak.
• Asam nitrat : menggumpalkan semen setelah ejakulasi
• Spermin : memberikan bau khas pada sperma.
• Seminim : merombak lisis sehingga semen mengencer
• Prostaglandin : untuk melancarkan pengangkutan spermatozoa dalam saluran kelamin jantan dan betina
• Elektrolit terutama Na, K, Zn, Mg untuk memelihara ph plasma seman
• Enzim pembuahan, inhibitor, hormon dan asam amino serta protein (Anonim., 2008).

Analisis sperma :

• Bau saat normalnya khas, tajam dan tidak berbau
• Warna normal yakni seperti lem, kanji atau putih kelabu
• Volume ; semen pada sapi dan domba mempunyai volume rendah tetapi konsistensinya tinggi, sedangkan semen kuda dan babi merupakan cairan yang lebih voluminous tetapi dengan konsentrasi sperma rendah.
• Koagulasi ; semen normal setelah ejakualsi segera menggumpal. Bila langsung encer ketika ditambpung berarti ada gangguan pada vesikula seminalis
• Viskositas ; kekentalan semen diperiksa dengan alat yang disebut viscometer. Secara sederhana dapat dilakukan dengan jalan mencelupkan batang kaca ke objek yang sudah ditetei semen, diangkat pelan diukur tinggi benang yang terjadi antra batang kaca dan objek sampai batas putus, dan normalnya 3 – 5 cm.
• PH ; semen diteteskan dengan batang kaca pada kertas PH berukuran warna petunjuk, dan setiap spesies warna tersebut berbeda – beda.
• Motilitas ; Jumlah yang bergerak maju ialah jumlah spermatozoa semua dikurangi jumlah mati. Dianggap normal jiak motil laju > 40 %. Menurut Rehan et al. yang normal % motilnya ialah 63 ± 16 SD dengan range 10 – 95, namun penelitian melaporkan spermatozoa yang tidak bergerak belum tentu mati, mungkin ada sesuatu zat cytotoxin atau antibody yang membuat nya tidak bergerak.
• § Morfologi ; Semen diwarnai dengan giemsa untuk melihat morfologinya, faktor yang membuat abnormal : penyakit alergi, terlalu sering ejakulasi, gangguan pada epididimis, stress dan gangguan hormonal dan saraf (Wildan., 1992).

Pada kancil warna semennya kekuningan, densitas kental, volume 30µl, konsentrasi 102.75±17.8x106 spermatozoa/ml, motilitas 40±1.1%, abnormalitas 21.03±1.05%, viabilitas 63±9.3%. Seminal plasma kancil mengandung protein 65 mg/100ml, 10,2-11.5 mg/100ml fruktosa, 22.07-24.5 mg/100ml sorbitol, 35.03-40.12 mg/100mlasam sitrat, 91.1-94.7 mg/ 100ml sodium, 0.1 mg/100ml potasium, 12.8-124.4 mg/100ml kalsium, 0.8-126.6 mg/100ml magnesium dan 10.17-11.2 mg/100ml khlorida. Pada SDS PAGE ditemukan sebanyak masing-masing 11 protein pada kisaran 15-218 kDa, dan pada kisaran 38-296 kDa.

Morfologi spermatozoa kancil mirip dengan spermatozoa ruminasia atau hewan domestik umumnya. Kepala pada spermatozoa berbentuk pipih dengan ujung membulat berukuran panjang 5.6µm dan lebar 4.8µm. Panjang keseluruhan spermatozoa (kepala-ekor) pada kancil yaitu 36.52µm. Berdasarkan ukuran, spermatozoa kancil adalah yang terkecil diantara hewan ruminansia. Akrosom dan membran spermatozoa kancil masing-masing mengandung senyawa yang berperan pada proses fisiologis spermatozoa, yaitu senyawa karbohidrat dengan residu gula galaktosa 1-3 dan D-N-Asetilgalaktosamin dan karbohidrat dengan residu gula D-N-Acetilglukosamin dan sialic acid.

Pada uji daya tahan/daya hidup, pada spermatozoa dengan medium tris-kuning telur yang disimpan pada 4oC selama 5 hari, motilitas spermatozoa hilang pada hari pertama penyimpanan, sedangkan viabilitas masih ditemukan sampai dengan hari kelima penyimpanan. Pada percobaan fertilisasi in vitro antara spermatozoa kancil dengan oosit mencit, terlihat spermatozoa kancil dapat memasuki oosit (tanpa zona pelusidal) dan membentuk pronukleus (http://web.ipb.ac.id/).

DAFTAR PUSTAKA


Anonim., 2008. Reproduksi dan Konservasi Hewan. Bag.Reproduksi dan Kebidanan. FKH.UGM. Yogyakarta.

Herdiawan., 2004. Pengaruh Laju Penurunan Suhu dan Jenis Pengencer Terhadap Kualitas Semen Beku Domba Priangan.

Wildan, Yatim. Reproduksi dan Embriologi.1994. Tarsito. Bandung.

http://web.ipb.ac.id/